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艰难梭菌（C·difficile）是一种革兰阳性粗长杆菌，是抗生素相关性腹泻和假膜性结肠炎的主要致病菌之一。艰难梭菌是人类肠道中的正常菌群成员，当人们长期使用或不正规应用氨苄西林、头孢菌素、红霉素、克林霉素等抗生素后，破坏了肠道菌群的生态平衡，引起肠道内菌群失调，耐药的艰难梭菌大量生长繁殖，导致抗生素相关性腹泻和假膜性结肠炎等疾病。[3][6]
艰难梭菌芽胞呈卵圆形、芽胞直径比菌体略大，位于次极端。严格厌氧，有周鞭毛。艰难梭菌最重要的致病物质是艰难梭菌毒素A（Tcd A）和（或）艰难梭菌毒素B（Tcd B），可灭活上皮细胞内的Rho蛋白家族，导致细胞凋亡并产生细胞病变效应，所致疾病统称为艰难梭菌感染（CDI）。[3]
艰难梭菌广泛分布于土壤，多种家畜和野生动物、甚至人类的粪便中，该菌的无症状携带者是主要传染源。[3]和其它细菌感染性腹泻一样，艰难梭菌通过粪-口途径传播，也可通过食用污染的食品、水而传播。人群普遍易感。儿童、老年人、有免疫抑制或慢性疾病者为高危人群，一些正在使用抗生素的患者是抗生素相关性腹泻的高危人群。[7]艰难梭菌感染（CDI）临床症状主要有发热、腹痛、腹泻等，由单一腹泻到中、重度感染。腹泻初期为水样便，后期可发展为脓血便。严重感染者伴有脱水、中毒性结肠炎和脓毒血症，粪便中可存有黏膜状物。[4]CDI采用免疫学方法或者分子诊断方法，从有临床症状病人的粪便标本中检测到细菌产生的毒素或毒素编码基因，用来辅助诊断。[3]治疗CDI的首要原则是尽可能停止正在使用的抗菌药物；其次是口服有效治疗药物。内科治疗除给予甲硝唑、万古霉素等有效药物外，其他药物还有非达霉素、利福昔明、替加环素和静脉注射免疫球蛋白等。外科治疗包括结肠切除、结肠旷置回肠造瘘、保留结肠并万古霉素冲洗术等干预手术。对于复发性 CDI，进行粪便菌群移植治疗，其治愈率高达90%以上。[4]
CDI的预防比较困难，尚无防疫疫苗。医疗从业人员应重视手卫生并使用含氯消毒剂，合理使用抗生素，从而降低CDI的发病率。[3]
命名
因为该菌对氧气极为敏感，在最初发现时难以从粪便中分离和培养而被命名为艰难梭菌。[3]
历史
1935年，艰难梭菌最初由霍尔（Halland）和奥图尔（O’Toole ）发现。1977年，临床证实艰难梭菌与临床上长期使用某些抗菌药物引起的伪膜性结肠炎有关，从而引起医学关注。[5]1978年，Tedesco首次鉴定产生毒素的艰难梭菌与林可霉素治疗后出现的假膜性结肠炎相关。[3]直到1997年，艰难梭菌二元毒素才被发现，并逐渐受到重视。欧美很多国家已经把艰难梭菌列为法定传染病必报的检测病原体。[5]
生物学特性
艰难梭菌为革兰阳性粗大杆菌，长3.0～16.9μm，宽0.5～1.9μm。有周鞭毛，芽胞呈卵圆形，位于菌体的次极端，芽胞直径比菌体略宽。艰难梭菌对氧气极敏感，严格厌氧，且分离困难。血琼脂平板上形成直径比较大、颜色为白色或淡黄色的粗糙型菌落，不溶血；在环丝氨酸-头孢西丁-果糖琼脂平板可产生黄色菌落，紫外线等下可见黄绿色的荧光。艰难梭菌的芽胞对平常使用的消毒剂、抗生素、高浓度氧或胃酸等，均具有很强的抵抗力，但其繁殖体对这些因素则比较敏感。用环丝氨酸-甘露醇等特殊培养基可以从粪便中分离到艰难梭菌。健康人群的粪便检出率约3%，其芽胞在外环境中可以存活数周至数月。[4][3]
致病性
艰难梭菌的致病物质主要包括黏液层、细胞表面蛋白84和外毒素等。黏液层附着在细菌表面，黏液层蛋白A(SlpA)有利于艰难梭菌在肠道上皮细胞表面黏附和定植；细菌分泌的细胞表面蛋白84（cell surface Protein84,Csp84) 是一种黏膜裂解酶，能导致结肠黏膜的降解；多数致病性艰难梭菌菌株能产生艰难梭菌毒素A(Tcd A)和（或）艰难梭菌毒素B（Tcd B），部分菌株还可产生艰难梭菌转移酶（这些细胞毒素导致细胞死亡的机制有所不同）。TCd A和TCd B都属于葡糖基转移酶，[3]编码这两种毒素的基因（tox）位于染色体上，机体长期使用抗生素会导致肠道中的双歧杆菌、乳杆菌等部分正常菌群被抑制，发生菌群失调，而耐药的艰难梭菌大量繁殖并释放毒素，[6]可灭活上皮细胞内的Rho蛋白家族，导致细胞凋亡并产生细胞病变效应，是艰难梭菌最重要的致病物质。[3]
传染源
艰难梭菌广泛分布于土壤，多种家畜和野生动物、甚至人类的粪便中，无症状携带者是重要的传染源，包括60%~70%的新生儿、3%的3岁以上儿童、3%的成年人和10%的老年人等。[3]
传播途径
艰难梭菌感染的传播途径主要是粪-口，也可通过食用污染的食品、水而传播。人与动物的密切接触也可以传播。通过医务人员的手或污染公共物品可造成医院感染引起医院内腹泻传播。[7]
易感人群
人群普遍易感，没有交叉免疫。儿童、老年人、有免疫抑制或慢性疾病者为高危人群，并且容易发生严重并发症，一些正在使用抗生素的患者是艰难梭菌感染造成腹泻的高危人群。[7]
潜伏期
潜伏期为数小时至数天、数周。多数为急性起病，少数起病比较缓慢。[7]
临床表现
临床上，大约15%～25%的抗菌药物相关性腹泻、50%～75%的抗菌药物相关性结肠炎和95%～100%的伪膜性肠炎是由CDI引起的。艰难梭菌感染（CDI）的临床症状可由单一腹泻到中、重度感染，包括发热、腹痛、腹胀等。腹泻初期为水样便，24小时内常多于3次。后期可发展为脓血便。重症患者的白色细胞增多。严重感染者的临床表现为水样便伴有脱水、中毒性结肠炎和脓毒血症，粪便中可存在有黏膜状物。患者临床症状最早可出现在开始用药后的数小时至2日之内，最晚可于停药后3周内出现。[4]
临床常见用氨苄西林、克林霉素等抗生素治疗5~10天后出现的水样腹泻，称为抗生素相关性腹泻。部分血水样腹泻患者会排出假膜，称为假膜性结肠炎，患者有发热、白细胞增多等全身中毒症状，严重者可危及生命。[6]艰难梭菌感染在临床上常伴有中毒性巨结肠、肠穿孔、感染性休克等并发症，甚至最终导致死亡。[4]
诊断标准
艰难梭菌感染者由于无症状携带者比例较高，即使从粪便中分离培养到艰难梭菌，也不能作为诊断疾病的依据。可以分别采用免疫学方法或者分子诊断方法，从有临床症状病人的粪便标本中检测到细菌产生的毒素或毒素编码基因，用来辅助诊断。[8]
患者出现中度至重度腹泻或者肠梗阻，一是粪便检测CD毒素或产毒素CD结果阳性；二是内镜下或组织病理检查显示伪膜性肠炎。满足这两个条件的任一条件，即可诊断为艰难梭菌感染。[4]
一般检查
轻度至中度艰难梭菌感染患者外周血白细胞可正常，严重感染者白细胞可达15×10 9 /L以上。血清降钙素原(procalcitonin，PCT)大于0.2ng/ml时，提示CDI有重症化趋势。合并脓毒血症时，相应脏器损害的功能指标异常，如血肌酐超过正常值1.5倍，血清白蛋白小于2.5g/L。[4]
标本采集
一般情况下，仅需要对稀便、水样便或半成形便进行CD 检测。对于疑似有CD感染和肠梗阻的患者，应通过直肠拭子进行检测。当出现明显腹泻症状 ( 24小时3次以上，持续时间超过2天）以及进行针对性治疗前，采集不成形粪便标本送检，送检样本不少于5ml，推荐采集10～20 ml。因为CD 毒素室温下易降解，取材后应在2小时内送检并立即检测；对于不能立即检测的，则需要将标本放置于4℃的冰箱内保存，保存时间不能超过 3天。[4]
培养
厌氧培养有CCFA培养基和CD显色培养基两种培养方法。CCFA 培养基的培养时间为48～72小时。通过加热粪便标本或乙醇预处理可以减少粪便正常菌群，筛选出细菌芽孢。菌落在紫外光下呈现黄绿色荧光，典型菌落可使用API 20A、Vitek 2 Compact 或者MALDI-TOF MS技术等进行鉴定。CD 显色培养基的培养时间为18～24小时，无需对粪便样本进行加热或乙醇预处理。CD在显色培养基上的菌落具有黑色、扁平、粗糙和边缘不整齐等特点，可以直接鉴定CD。[4]
谷氨酸脱氢酶检测
谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase，GDH)用于筛查疑似CDI患者粪便样本中是否存在CD。使用酶免疫方法(enzyme immunoassays，EIAs)直接检测粪便标本中的GDH抗原。检测时间约1至2小时。GDH试验阴性，可直接报告临床用于排除 CDI；GDH试验阳性，则需要进一步检测其毒素或毒素基因进行确证。[4]
细胞毒性试验
细胞毒性试验(cell cytotoxicity assay，CCTA)，即细胞毒性中和试验(cell cytotoxin neutralization assay，CCNA)，用于直接检测粪便标本中存在的CD毒素。CCTA 是实验室诊断CD的金标准，特异性强，敏感度高(最低可检测出10pg毒素)。具体方法是，将粪便标本离心，上清经0.45μm滤膜过滤，将无菌PBS稀释的粪便滤液加入细胞悬液(Vero或Hep2细胞)，分别加入和不加入抗CD毒素的中和抗体，37℃5%CO2环境培养，24小时、48小时后显微镜下观察细胞病变效应(cytopathiceffect，CPE)，而加入特异性抗毒素抗体能阻止这种细胞病变。[4]
产毒素培养
产毒素培养(toxigenic culture，TC)用于检测CD菌株的产毒素能力。将粪便标本接种于CCFA培养基或CD显色培养基上，37℃厌氧培养至少48小时，挑取典型菌落接种至液体培养基中，厌氧培养48小时，0.45μm滤膜过滤培养上清进行细胞毒性试验。也可用EIAs检测固体培养基上菌落产毒素能力，检测时间为2～3日，但敏感度稍低。[4]
毒素免疫检测
常用EIAs（酶免疫方法）直接检测腹泻粪便标本中的CD毒素，用单克隆抗体特异性结合CD A/B毒素蛋白进行检测。EIAs检测CD毒素常和GDH检测或核酸扩增技术(nucleic acid amplification tests，NAATs)联合应用，用于 CD 感染实验室两步法或三步法诊断。[4]
艰难梭菌毒素基因检测
采用实时PCR或环介导等温扩增法(loop-me-diated isothermal amplification，LAMP)等分子生物学技术，定性检测粪便样本中的 CD 毒素基因。检测系统包括美国的GeneXpert(Cepheid)、法国的FilmArray(梅里埃)等，将样品提取、纯化、核酸扩增、产物自动化检测整合，2小时内可以完成检测。GeneXpert可以检测tcdC基因的突变和缺失，预测高产毒菌株RT027型CD。采用NAATs检测方法可作为唯一的独立测试技术检测产毒素CD。[4]
实验室诊断流程
三步法：先使用GDH试验初筛，GDH阳性进行毒素EIAs试验，二者结果不一致使用CCTA、TC或NAATs确证；两步法：同步联合检测GDH和毒素EIAs试验，二者结果不一致使用CCTA、TC或NAATs确证。[4]
CT检查
如果艰难梭菌感染患者结肠壁增厚、结节状结肠袋增厚、水肿厚度大于4cm，特别是炎症部位在升结肠时，CT检查对于重症CDI感染患者具有一定的辅助诊断意义。暴发性CDI常出现腹水、缆绳征等。[4]
内镜检查
艰难梭菌感染在缺乏病原学依据或难以与其他炎症性肠病相鉴别时，内镜检查是诊断CDI的重要手段之一。内镜检查下的特征表现为伪膜性病变，主要征象包括黏膜充血、水肿、糜烂、溃疡、直肠乙状结肠有多发性隆起的斑片或融合为大片的灰绿色、黄褐色伪膜覆盖黏膜表面；严重者病变融合；伪膜邻近的黏膜呈现水肿、充血，触及易出血，也可见散在溃疡；伪膜性病变主要累及左侧结肠或全结肠，少数累及回盲部。部分CDI患者内镜下表现不典型，尤其炎症性肠病合并CDI时多无特征性伪膜性病变。[4]
治疗
根据患者感染的严重程度，给予不同的治疗方案。治疗CDI的首要原则是尽可能停止正在使用的抗菌药物；其次是口服有效治疗药物。内科治疗除给予甲硝唑、万古霉素等有效药物外，内科治疗的其他药物还有非达霉素、利福昔明、替加环素和静脉注射免疫球蛋白等。[4]
治疗方案
| 患者 | 症状 | 治疗方案 |
|---|---|---|
| 无症状CD携带者 | 不存在腹泻、肠梗阻、结肠炎等临床症状的患者 | 无需进行CD实验室检测及治疗 |
| 轻、中度感染者 | 有腹泻等肠炎样症状，但没有重症感染表现 | 给予甲硝唑500mg(口服或胃管入)，每 8小时一次 |
| 重症感染 | 有腹泻，且存在因CDI 导致的任何一项异常：白细胞＞15×109/L、血肌酐较基线升高大于50%、内镜发现伪膜 | 给予万古霉素125mg溶液(口服或胃管入)，每6小时一次 |
| 重症感染伴并发症 | 符合重症感染诊断标准，因CDI导致至少一项异常：低血压、肠梗阻、中毒性巨结肠或弥漫性结肠炎、肠穿孔、需结肠切除、因CDI入住重症监护病房治疗 | 需外科、感染内科医生会诊，评估结肠切除手术指征。给予万古霉素500mg，每6小时一次，配伍甲硝唑 500mg(胃管入)，每8小时一次；病情稳定后，万古霉素减量至125mg，每6小时一次，停用甲硝唑；口服给药受限或完全性肠梗阻的患者，可经Foley导管（福莱导尿管）给予万古霉素500mg(溶于100ml生理盐水)直肠保留灌肠每6小时一次，配伍甲硝唑500mg，静脉输注，每8小时一次（该项治疗存在结肠穿孔风险） |
| 复发性CDI | 完成疗程的CDI患者，芽孢清除失败或感染了新的CD | 第一次复发，可采用原治疗方案；第二次复发，给予万古霉素并逐渐减量，配合脉冲式给药模式或粪便菌群移植 |
| 以上资料来源于《协和医学杂志》[4] | ||
注意事项
| 事项 | 注意内容 |
|---|---|
| 疗程 | 10～14日 |
| 使用万古霉素或去甲万古霉素（口服或胃管入） | 服用甲硝唑治疗5日无效；复发性CDI（第二次发作）；妊娠；65岁（含）以上的患者；存在其他甲硝唑治疗禁忌及显著不良反应 |
| 仍需使用广谱抗菌药物治疗其他部位感染的CDI患者 | 尽可能替换在用的诱发CDI的头孢菌素、克林霉素和喹诺酮类等抗菌药物；尽可能缩短疗程；若调整药物后CDI有所缓解，应给予CDI疗程10～14日；若诱发CDI的抗菌药物无法替代或停药，则抗CDI药物需要延长到抗菌药物疗程结束1周 |
| 治愈检测 | 抗CDI药物治疗不需要检测 CD以确定是否治愈 |
| 止泻药的使用 | 尽可能避免使用止泻药 |
| 质子泵抑制剂的使用 | 可增加CDI的患病风险，尽可能避免使用质子泵抑制剂的使用 |
| 预防治疗 | 非CDI患者在接受抗菌药物治疗基础感染病期间，不需要给予甲硝唑或万古霉素进行 CDI 的预防治疗，会增加CDI的患病风险 |
| 接触隔离 | CDI患者住院期间应进行接触隔离 |
| 卫生与消毒 | 使用水、肥皂进行手卫生，不能使用含乙醇的手消毒剂 |
| 以上资料来源于《协和医学杂志》[4] | |
外科治疗
所有的CDI重症患者均应进行腹部CT检查，以明确是否存在中毒性巨结肠或全结肠炎，尽早确定外科干预的时机；若患者CDI导致的临床情况不稳定，出现肠穿孔、中毒性巨结肠、内科治疗无效、重症感染性休克等状况，应尽早进行外科干预，包括结肠切除、结肠旷置回肠造瘘、保留结肠并万古霉素冲洗术等；结肠切除术的病死率高达25%～75%；手术应在血清乳酸大于5mmol/L前实施；结肠次全切除术保留直肠的CDI患者，术后仍需持续进行内科药物治疗。[4]
粪便菌群移植
| 项目 | 内容 |
|---|---|
| 适应证 | 仅适用于复发性 CDI，尤其是第三次发作以后。治愈率高达90%以上，但对于接受结肠次全切除术的患者，效果不确定 |
| 受者要求 | 操作前2日不接受任何抗菌药物治疗，操作前晚餐进流食、并接受灌肠或导泻剂清理肠道 |
| 粪便供者要求 | 过去6个月内未使用过抗菌药物、免疫功能正常、无纹身、未吸食毒品、无高危性行为、未被监禁、近期无疫区旅游史、无炎症性肠病等慢性消化道疾病 |
| 粪便供者筛查 | 血液检查：乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、艾滋病病毒及梅毒；粪便检查：虫卵和寄生虫、CD、粪便培养和药敏、鞭毛虫抗原 |
| 供者粪便收集 | 操作前晚上，供者服用导泻药，第二天早上收集粪便，混入500ml 盐 水；混匀粪便；使用咖啡滤纸过滤粪渣制成悬液；悬液保存在低温容器中运送，在6小时内完成移植 |
| 移植途径 | 多数经结肠镜进行粪菌移植，少数情况使用鼻胃管进行操作 |
| 移植方法 | 受者到达操作间时服用盐酸洛哌丁胺胶囊(易蒙停)2片，缓解肠蠕动；准备好的500ml粪菌悬液经结肠镜注入患者右半结肠；受者尽可能避免排便，至少保留2小时 |
| 以上资料来源于《协和医学杂志》[4] | |
预防免疫
艰难梭菌广泛存在于医疗环境和自然环境中，预防CDI比较困难。医疗从业人员应重视手卫生并使用含氯消毒剂，对芽胞污染的医疗环境可采用过氧化氢气化灭菌，合理使用抗生素等，可显著降低CDI的发病率。尚无疫苗用于预防。[8]
流行病学
CDI已经对对全球性公共健康造成威胁。美国和欧洲的CDI成为医院相关性腹泻的首要病因。美国疾病控制和预防中心 (Centers for Disease Control and Prevention，CDC)于2013 年发布的统计数据显示，美国每年CDI患者超过25万，其中至少1.4万人死于该种疾病。加拿大的CDI发病率从1997年的3.8/万住院日上升至2005年的9.5/万住院日。韩国的成人住院患者CDI发病率从2004年1.7/万住院日上升至2008年的2.7/万住院日。2007至2008年上海一家医院研究发现，其住院患者CDI的发病率为17.1/万住院患者。[4]
2002年之后，一种高产毒CD在北美和欧洲暴发流行，其PCR-核糖体分型027型/脉冲场凝胶电泳分型NAPl型/限制性内切酶分型BI型(简称RT027/NAP1/BI)，该型菌株引起的临床症状更加严重且传播性更强，易复发，预后差，导致CDI发病率快速增加。成为美国、比利时、英国和西班牙等国家和地区的优势流行菌株。澳大利亚、墨西哥、智利、希腊、捷克和波兰等国家也相继发现此类高产毒株。中国的香港、台湾和大陆地区也相继发现了RT027型菌株。在中国，引起感染的CD有其独特的流行病学特征，主要流行菌株为RT017(ST37)，RT046(ST35)和RT012(ST54)。中国健康人分离的CD则以多位点序列分型ST54、ST3和ST2为主。[4]
参考资料 8
- 参考 1
- 参考 2
- 参考 3
- 参考 4
- https://d.wanfangdata.com.cn/Periodical/ChlQZXJpb2RpY2FsQ0hJTmV3UzIwMjMxMjI2EhB6Z2tzc3p6MjAxNjA0MDE1Ggg0aXNxcjlsag%3D%3D
- 参考 6
- 参考 7
- 参考 8