河豚毒素

存在于河豚中的海洋毒素

河豚毒素

河豚毒素（tetrodotoxin，简称TTX）是由鱼类分离提取的一种非蛋白剧毒毒素，河豚毒素是最早发现的海洋生物毒素之一，河豚毒素与石房蛤毒素、肉毒鱼毒素合称海洋三大公害毒素。[4][6]河豚毒素不仅分布在河豚中，在水螅、蝾螈、斑足蟾等动物中也有，主要分布在河豚的性腺、肝脏、脾脏、皮肤、血液等部分里。[7][8]河豚毒素是氨基氢化喹啉化合物，为典型的Ｎa⁺通道抑制剂，分子式为C₁₁H₁₇N₃O₈，相对分子质量为319.27，含有河豚素和河豚酸，为无色针状结晶，微溶于水、无水乙醇和乙醚中，溶于稀乙酸，几乎不溶于其他有机溶剂，对热较稳定。[0][4][9]河豚毒素是一种毒性很强的神经毒素，是高选择性的Ｎa⁺通道阻断剂主要作用于神经系统，阻断神经肌肉间的冲动传导，使神经末梢和中枢神经发生麻痹，同时引起外周血管扩张，使血压急剧下降，最后出现呼吸中枢和血管运动中枢麻痹，以致死亡。[3]关于河豚毒素的起源有3种观点：毒动物可在体内合成毒素的内因说、食物链学说和微生物起源学说(外因说)。目前普遍认为，河豚毒素是一种生物次级代谢产物，由微生物在含毒动物体内产生，并通过食物链逐渐在体内积累。[10]自1909年从河豚体内分离出了河豚毒素，人们一直认为河豚毒素只存在于河豚体内。直到1964年，Mosher等从美国加州蝾螈（Taricha torosa）体内分离到河豚毒素，才打破了这种说法。[11]

河豚毒素（tetrodotoxin，简称TTX）是由鱼类分离提取的一种非蛋白剧毒毒素，河豚毒素是最早发现的海洋生物毒素之一，河豚毒素与石房蛤毒素、肉毒鱼毒素合称海洋三大公害毒素。[5][7]河豚毒素不仅分布在河豚中，在水螅、蝾螈、斑足蟾等动物中也有，主要分布在河豚的性腺、肝脏、脾脏、皮肤、血液等部分里。[8][9]河豚毒素是氨基氢化喹啉化合物，为典型的Ｎa⁺通道抑制剂，分子式为C₁₁H₁₇N₃O₈，相对分子质量为319.27，含有河豚素和河豚酸，为无色针状结晶，微溶于水、无水乙醇和乙醚中，溶于稀乙酸，几乎不溶于其他有机溶剂，对热较稳定。[1][5][10]河豚毒素是一种毒性很强的神经毒素，是高选择性的Ｎa⁺通道阻断剂主要作用于神经系统，阻断神经肌肉间的冲动传导，使神经末梢和中枢神经发生麻痹，同时引起外周血管扩张，使血压急剧下降，最后出现呼吸中枢和血管运动中枢麻痹，以致死亡。[4]

发现历史

关于河豚毒素的起源有3种观点：毒动物可在体内合成毒素的内因说、食物链学说和微生物起源学说(外因说)。目前普遍认为，河豚毒素是一种生物次级代谢产物，由微生物在含毒动物体内产生，并通过食物链逐渐在体内积累。[11]自1909年从河豚体内分离出了河豚毒素，人们一直认为河豚毒素只存在于河豚体内。直到1964年，Mosher等从美国加州蝾螈（Taricha torosa）体内分离到河豚毒素，才打破了这种说法。[12]

在公元前2500年前埃及就有关于河豚等有毒鱼类的记载。[6]河豚毒素的生产最早起源于日本，1909年日本学者田原良纯在河豚鱼中首次提取出河豚毒素粗品，在1950年的时候获得了毒素结晶。[3][4][13]在1950~1957年，还从红鳍东方鲀和紫色东方鲀卵巢中独立分离出来结晶态的河豚毒素。[4]

分布情况

河豚毒素及其类似物在河豚鱼里的分布主要在性腺、肝脏、脾脏、皮肤、血液等部分里，除了分布在河豚鱼里，还广泛分布于多种脊椎动物及无脊椎动物体内，例如两栖动物、鱼类、棘皮动物、节肢动物、软体动物、纽虫、扁形动物等。已报道的体内或体表存在河豚毒素及其类似物的生物有：河豚鱼、蝾螈、虾虎鱼、蛙类、马蹄蟹、海星、纽虫、箭虫、环节动物、石灰质藻类等。[12]

除了存在于多种动物体内或体表，人们从多种海洋动物、海洋沉积物、淡水沉积物中也分离到了产河豚毒素及其类似物的微生物，它们分别属于弧菌属(Vibrio)、放线菌属(Actinomycetes)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)等。[12]

河豚毒素不仅在东南亚地区出现，还扩散到了太平洋和地中海地区。[14]

化学结构

河豚毒素的分子式为C₁₁H₁₇N₃O₈，是一种笼形原酸酯zhǐ类生物碱，带有复氧环己烷wán，其结构特征为具有多羟基氢化5，6苯吡啶母核，含有1个碳环、1个胍基、6个羟基，在C-5和C-10位有一个与半醛糖内酯连的分开的环，河豚毒素的化学结构如下所示。[6][15]

河豚毒素
河豚毒素

物理性质

河豚毒素粗品为棕黄色粉末，纯品为无臭、易潮解的白色结晶体。[6][5]河豚毒素的熔点为225ºC，对热不稳定，微溶于水、无水乙醇和乙醚中，溶于稀乙酸，易溶于pH3~7的有机酸和无机酸水溶液。几乎不溶于其他有机溶剂。[1][7][16]

化学性质

河豚毒素在常温常压下很稳定，在220℃以上颜色发黑而不分解，超过220℃就会分解并炭化。[4]河豚毒素在中性或弱有机酸中对热稳定，强酸或强碱水溶液（如4%NaOH溶液处理20min)可完全破坏河豚毒素。[4][16]

提取方法

可以利用河豚毒素的弱碱性质，用稀酸在干燥的河豚内脏提取，并加热除去蛋白后得到河豚毒素粗品，再进一步纯化制备精品，常用的提取工艺有：活性炭柱层析法、离子交换树脂-活性炭柱层析法和苦味酸盐精制法。[17]

活性炭柱层析法

活性炭柱层析法是利用层析柱将混合物的各组分分离开，从而得到河豚毒素。该方法先将河豚鱼卵巢切碎后加热后，冷却后除去凝固蛋白，滤液浓缩后除去沉淀，进一步用活性炭柱层析，洗脱后得到主要成分，将其蒸发后析出河豚毒素，析出物结晶即得河豚毒素成品。[17]

离子交换树脂-活性炭柱层析法

离子交换是利用合成的离子交换剂作为吸附剂，将溶液中的物质，依靠库仑力吸附在交换剂上，然后用合适的洗脱剂将吸附物质从交换剂上洗脱下来，从而达到分离、浓缩、提纯的目的。这个方法先将河豚鱼卵巢切碎浸泡后，加热除去凝固蛋白，滤液经过层析柱分离后，洗脱后加入活性炭得到提取液，浓缩后得到粗品。[17]

苦味酸盐精制法

将粗品毒素和苦味酸盐溶于沸水中，趁热过滤，冷却滤液，分离结晶沉淀，此沉淀在热水中结晶沉淀3次，得黄色针状结晶状的河豚毒素苦味酸盐。将此盐在热水中溶解后用氨水调节pH，冷却后过滤出固体并用水洗涤，再溶于少量醋酸，加氨水再沉淀得到比较纯的河豚毒素。[17]

检测方法

河豚毒素常用的含量检测方法有小鼠生物法，酶联免疫吸附法、高效液相色谱法和组织培养法等。[9]

小鼠生物法

小鼠生物法是目前中国和日本等国的法定河豚毒素检测方法，也是最常用的生物检测法，其原理是给一定体质量的小鼠注射毒素提取液后，根据毒素的注射剂量与小鼠死亡时间的线性关系，通过观察小鼠的死亡时间推算河豚毒素的含量，通常以样品提取液完全注入小鼠腹腔开始计时，到小鼠停止呼吸作为判断小鼠死亡的标准。[6]

小鼠生物法以生物体的反应作为指标测定毒素含量，是最直观的检测方法，但该方法操作繁琐，易受主观因素干扰，检测结果不稳定，重复性较差，且在伦理方面存在争议，此外还需考虑提取溶剂对小鼠生理反应的影响。[6]

酶联免疫吸附法（ELISA)

酶联免疫吸附法结合了抗原抗体的免疫反应和酶的高效催化作用，分为固定化抗原竞争抑制吸附和固定化抗体直接竞争吸附2种类型。[6]这个方法是将样品中的河豚毒素经提取、脱脂后与定量的特异性酶标抗体反应，多余的酶标抗体则与酶标板内的包被结合，加入底物后显色，与标准曲线比较来测定河豚毒素的含量。[18]

高效液相色谱法（HPLC）

高效液相色谱法是常用的仪器检测方法，其原理是待测组分随着流动相在固定相上的吸附与解吸，不同组分的保留时间不同，从而实现样品的分离。[6]这个方法是利用河豚毒素在NaOH溶液中加热产生荧光的特性以高效液相色谱同荧光检测器联用测定河豚毒素的含量，检测限达可以达到1nm，此方法至今仍是河豚毒素检测较为理想的方法。[19]

组织培养法

组织培养法的原理是乌本（箭毒）苷gān会抑制Na⁺-K⁻-ATP酶的活性，藜芦定能刺激神经细胞的Na⁺内流和动作电位的去极化，它们可以使小鼠细胞成神经细胞流入大量的Na⁺，使细胞肿胀而死，而河豚毒素可以结合受体阻断这种作用，保持细胞正常形态及活性。[6][20]这个方法是用一定浓度的乌本(箭毒)苷和藜芦定处理细胞，使其形态发生变化，然后通过光镜观察河豚毒素导致细胞形态恢复情况，用恢复率和河豚毒素浓度之间的关系来估算河豚毒素的含量；还可以将存活的细胞用中性红染色后在540nm处测出其吸收值来估算存活细胞，进而算出河豚毒素的含量。[20]

这个方法简单，容易操作，但是不能区分河豚毒素的衍生物，特异性差。[6]

对Na⁺通道的阻断作用

河豚毒素对Na⁺通道的选择性极高，能阻止Na⁺进入细胞内，因而可阻止神经和肌肉产生兴奋活动。因为河豚毒素分子结构中带有一个胍基，体积与钠离子相同，这种“插入”假说认为Na⁺孔固定河豚毒素是通过静电吸引，而Na⁺离子通道的长度为5Å左右，正好能容纳一个胍基。因此Na⁺离子流动受阻的原因，可能是河豚毒素的胍基部分被固定在Na⁺通道附近，排斥钠离子接近通道，从而阻滞了神经冲动的传导。[21]

心血管作用

河豚毒素的显著作用之一是产生严重的低血压，5×10⁻⁴ug·g⁻¹就可产生降压作用。在α和β肾上腺素受体阻断剂存在时，河豚毒素具有血管舒张作用，河豚毒素能使血管逐渐麻痹，外周血管阻力减小，造成血压下降。[21]

呼吸抑制作用

河豚毒素所致的呼吸衰竭与其抑制呼吸中枢有关，但是也有学者认为，呼吸神经和呼吸肌麻痹才是河豚毒素导致呼吸衰竭的主要因素。河豚毒素除产生外周心肺活动失常外，尚可作用于呼吸节律中枢的网状结构，使该网状结构中某些成分的机能和位置发生特异性紊乱。由此推测，河豚毒素引起的呼吸衰竭以至死亡与中枢和外周成分都有关。[21]

其它药理作用

河豚毒素除了有以上的药理作用，还具有较强的抑制细胞有丝分裂的作用，抗心律失常作用、镇痛作用、预防肾功能衰竭的作用。[21]

应用领域

可以利用河豚毒素具有选择性抑制钠离子通道的机制，将河豚毒素可以作为工具药来应用到医疗卫生行业。[6]如临床常用的抗心律失常药如奎尼丁、利多卡因等，不仅能阻断心肌Na⁺通道，也同时影响Ca²⁺或K⁺通道；而河豚毒素选择性阻断Na⁺通道，不影响Ca²⁺和K⁺通道。这种专一性使河豚毒素成为神经生理学、肌肉生理学研究领域中很有用的药理学工具药。[22]

目前河豚毒素具有止痛、解毒和局部麻醉等功效。河豚毒素可以运用到医疗方面，比如微量的河豚毒素对人非常有用，如晚期癌症病人可以通过使用河豚毒素来缓解疼痛，河豚毒素起效迅速，副作用少，可以口服，也可以注射，相比可卡因这类药物没有任何依赖性，即称无隐性或非阿片肽性。在戒毒方面，可用于使用依赖性麻醉病人或其他人群。[23]在麻醉方面，河豚毒素的麻醉作用比比常用麻醉药可卡因强16万倍，而且持续时间长，临床上河豚毒素的针剂可以代替吗啡、杜冷丁等，用于治疗神经痛、关节痛、肌肉痛、麻风痛以及创伤、烧伤引起的疼痛，一般生效较吗啡、杜冷丁迟，镇痛时间长达12h～20h。[22]日本的传统医学中还曾经使用河豚毒素来治疗麻风患者的神经痛，还可以抑制破伤风患者的痉挛。[24]因此，河豚毒素作为药物有广泛和不可取代的应用价值。[23]

毒理学数据

河豚毒素的小鼠的口服半致死剂量(LD₅₀)为232ug/kg(河豚毒素/体重)。[25]

毒性

河豚毒素的毒性极强，中毒潜伏期短，死亡率高，目前无有效的解毒剂。[17][22]河豚毒素对人体的致死量为6~7ug/kg体重，中毒的临床表现和中毒的剂量有关，最早出现的症状是感觉异常，会在一小时之内出现，如由舌尖、口腔波及至四肢;有时可见消化道症状，包括恶心、呕吐，少数病例会有腹泻。随后会出现肌肉无力、头痛、共济失调、头晕，患者还会有死亡恐惧感。随着病情的发展，会出现弛缓性麻痹，表现为出汗、胸痛、瞳孔固定放大、吞咽困难、失音、抽搐、心动过缓、低血压和心传导阻滞。最后出现呼吸肌麻痹和心律失常，数小时内会出现死亡。经临床治疗后，轻度中毒患者症状可缓解，但重度中毒者在数日内难以痊愈。[5]

中毒机制

河豚毒素的毒作用机制为阻遏神经和肌肉的传导。河豚毒素除直接作用于胃肠道引起局部刺激症状外，进入血液后，能迅速使神经末梢和神经中枢发生麻痹，继而各随意肌的运动神经麻痹；毒量增大时毒及迷走神经、影响呼吸，导致脉搏迟缓；严重时体温和血压下降，最后导致血管运动神经和呼吸神经中枢麻痹而引起迅速死亡。对于河豚毒素的作用机制已研究得十分清楚，河豚毒素可选择性地抑制可兴奋膜上电压依赖性钠通道的开放，从而阻止神经冲动的发生和传导，使神经肌肉丧失兴奋性。[5]

急救措施

河豚毒素中毒可以通过催吐、洗胃和泻下的方法来排出毒物。还可以进行用药物进行对症处理，如出现呼吸困难则可用山梗菜碱、尼可刹米等药物注射；肌肉麻痹可用士的宁(番木鳖碱)；另外可用高渗葡萄糖液保护肝脏、并促进排毒。[5]

预防措施

河豚毒素食物中毒的预防措施主要是避免人类经口暴露含有河豚毒素的生物物种。[5]如需要加工食用的河豚，应在有条件的地方集中加工，必需先除去内脏、皮、头等含有毒的部位，反复冲洗肌肉，洗净血污，加入2%碳酸氢钠处理24h经检验合格后方可销售。[8]

法规限制

日本现行的《食品卫生法》规定了允许食用的河鲀tún鱼品种及部位、养殖、专业处理方法和操作人员要求等，并根据不同地域的差别修改细则，从整体上完善河鲀鱼管理办法和标准。韩国水产品管理法规中规定了河鲀鱼肉和皮中的河豚毒素的含量不得超过10Mu/g（1 Mu/g = 0.2 μg/g ； 10Mu/g = 2ug/kg），并对从中国进口的河豚鱼在品种、产品类型和合格证书等方面作出特殊规定。1990年11月20日，中国卫生部颁布的《水产品卫生管理办法》中禁止河豚鱼流入市场，2010年该禁令被解除。第二年国家食品药品监督管理局规定严禁任何餐饮服务提供加工制作鲜河豚鱼，2016年原农业部和国家食品药品监督管理总局决定有条件放开养殖红鳍东方鲀(Takifugurubripes)和养殖暗纹东方鲀(Takifugu obscurus)加工经营，规定河豚产品的河豚毒素含量不得高于2.2mg/kg。[26][27][28]

参考资料 28

  1. Tetrodotoxin | C11H17N3O8 — PubChem
  2. 参考 2
  3. 参考 3
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  14. Tetrodotoxin: chemistry, toxicity, source, distribution and detection — National Library of Medicine
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  26. 参考 26
  27. 首批合法养殖河豚鱼"游"上餐桌 "盒马鲜生"已开卖 — 中华人民共和国农业农村部
  28. 参考 28
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