睾丸酮丛毛单胞菌

环境正遭受到类固醇化合物的严重污染，人类健康面临着重大威胁，睾丸酮tóng丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)对类固醇化合物的降解作用为我们对类固醇化合物污染的治理。睾丸酮丛毛单胞菌(comamonastrstosteroni)是丛毛单胞菌属的一个种，在自然界中分布广泛，为条件致病菌，可引起呼吸道等部位的感染。国内尚未见从血液中分离出该菌的报道。我们从血液培养中连续两次分离出同一种睾丸酮丛毛单胞菌。

睾丸酮丛毛单胞菌 ( C.testosteroni)是丛毛单胞菌属 ( Comamonas)的一个种 ,在自然界中分布广泛 ,为条件致病菌 ,可引起呼吸道等部位的感染。国外已有从血液、脓液、尿液和呼吸道分泌物等临床标本分离出该菌的报道。我们从血液培养中连续两次分离出同一种睾丸酮丛毛单胞菌。睾丸酮丛毛单胞菌 ( C.testosteroni)是丛毛单胞菌属 ( Comamonas)的一个种 ,在自然界中分布广泛 ,为条件致病菌 ,可引起呼吸道等部位的感染。国外已有从血液、脓液、尿液和呼吸道分泌物等临床标本分离出该菌的报道 ,但作者尚未见国内有关报道。

睾丸酮丛毛单胞菌（comamonas trstosteroni）是丛毛单胞菌属的一个种，在自然界巾分布广泛，为条件致病菌．可引起呼吸道等部位的感染。国内尚未见从血液中分离出该菌的报道。我们从血液培养中连续两次分离出同一种睾丸酮丛毛单胞菌。而睾丸酮丛毛单胞菌胞菌在降解类固醇、多环芳烃类物质 PHAs 等稳定 原始菌株只具有 Amp 抗性，只能生长在含 Amp 的污染 化 合 物 中具 有 重 要 作 用 Coulter and Talalay 培养基中生长，不能在含有这两种抗生素的培养基1968 Goyal and Zylstra 1996 mobus et al. 1997 中生长。Mobus and Maser 1998 Maser et al. 2000 2001 bp M 1 2Skowasch et al. 2002，在污染环境修复中扮演着重要的角色。睾丸酮丛毛单胞菌的 3琢HSD/CR 是一种 15000 10000诱导酶，在该细菌染色体上 3琢HSD/CR 基因的上游 7500 5000存在两个 10 bp 的回文操纵基因序列，该基因附近还存在两个抑制子 RepA 和 RepB，通过转录和翻译抑 2500 2000制该基因的表达 Xiong and Maser 2001 Xiong et al.2001 2003a b c。 1000 活化因子activator是指与增强子或与活化因子 750结合区域结合的蛋白，能够提高转录的起始速度 500Browning and Busby 2004。戴艺民等2005 2006将 250来自睾丸酮丛毛单胞菌的全长 564 bp 和部分409 100bp activator 分 别 与 来 自 睾 丸 酮 丛 毛 单 胞 菌 的3琢HSD/CR 在体外进行共转化研究，

1 PCR 筛选工程菌酮丛毛单胞菌的 activator 能提高 3琢HSD/CR 转录 Figure 1 Genetically engineered bacteria screened by PCR速率。 C. Wide range DNA marker 10015 000 1： test pa M：由于人工合成和生物自身代谢排入环境中的类 C. 2： testpb固醇污染物与日俱增，有必要对睾丸酮丛毛单胞菌 .基因工程菌的 Southern 检测进行改造，提高该细菌的 3琢HSD/CR 等一系列降解酶基因的表达，才能达到利用睾丸酮丛毛单胞菌快 提取睾丸酮丛毛单胞菌野生菌 在图中简写为速降解该类污染物、净化环境的目的。本研究利用电 C. C. test，下 同、 testpa 和 C. testpb 的 染 色 体穿孔法将重组质粒 pKtac1act1 和 pKtac1act2 整合 DNA， EcoR玉酶切后进行杂交检测， ddH2O 作 用 以化入睾丸酮丛毛单胞菌的染色体中，筛选得到 2 株 为阴性对照，以 EcoR玉酶切 pKtac1 作为阳性对照。睾丸酮丛毛单胞菌基因工程菌，对这两株基因工程 Southern 杂交的结果见图 2。从 Southern 杂交图可菌的关键酶 3琢HSD/CR 表达情况和细菌稳定性进 见，基 因 工 程 菌 C .testpa 和 C.testpb 的 染 色 体行检测分析，以期为进一步利用工程菌提供理论基 DNA 有明显的杂交条带，睾丸酮丛毛单胞菌的染色础。体 DNA 没有杂交条带的出现。由于睾丸酮丛毛单胞 菌的染色体上不存在 pK18 的片段，而在挑选出来的1 结果与分析 基因工程菌的染色体上能够检测到 pK18 的片段的1.1 利用 PCR 筛选基因工程菌 存在，由此可见质粒 pKtac1act1 和 pKtac1act2 确实 整合入睾丸酮丛毛单胞菌的染色体中。质粒电穿孔转化后的细菌在含有 Amp 和 Kan的 LB 固体培养基上 30℃ 过夜培养。挑选单克隆在 1.3 睾丸酮对细菌的诱导含有 Amp 和 Kan 的 LB 液体培养基中进行过夜振 睾丸酮丛毛单胞菌的 3琢hsd/CR 是受睾丸酮诱荡培养，提取重组子的染色体 DNA 作为模板， A1 以 导的酶。在 LB 培养基中添加睾丸酮对 Comamonas和 A2 为引物进行 PCR 扩增，扩增产物用 1.0的琼 C. testosteroni、 testpa 和 C. testpb 进 行过夜 培养，脂糖凝胶进行电泳 图 1。筛选到 2 株基因工程菌，睾丸酮的终浓度为 270 滋g/mL。分别提取这 3 个菌即质粒 pKtac1act1 同源整合入睾丸酮丛毛单胞菌 株的总蛋白，将细菌的总蛋白定量为 1 mg/mL，稀释染色体产生的工程菌 C. testpa 和质粒 pKtac1act2 100 倍后，用 ELISA 法检测 3琢HSD/CR 的表达量，同源整合入睾丸酮丛毛单胞菌染色体产生的工程菌 结果如图 3 所示。从图中可见，睾丸酮丛毛单胞菌野 睾丸酮丛毛单胞菌工程菌构建及稳定性分析