色谱法

色谱法（chromatography）又称层析法，是一种对混合成分进行分离和分析的物理化学方法^[2]。色谱法一词由“chromato”（颜色）和“graphy”（图示法）构成^[4]。相比于经典的分离技术（如萃取、蒸馏、重结晶等），它分离效能高，并且分离和分析功能兼备^[3]。

色谱法创始于20世纪初，1903年-1906年茨维特应用吸附原理，把碳酸钙装在一个竖立的玻璃管中，将植物叶子的石油醚提取液倒入管中，然后加入石油醚自上而下淋洗，之后形成了一圈圈不同层次的色带，分别是胡萝卜素、叶黄素和叶绿素A、叶绿素B。20世纪30年代相继出现了薄层色谱法与纸色谱法。50年代气相色谱法兴起，并采用了各种高灵敏度检测器及自动记录等装置，使分析趋于自动化。70年代高效液相色谱法出现，80年代末发展起来的高效毛细管电泳法对于生物高分子的分离具有独特的特点。^[4]

色谱法根据两相的物理状态可分为：气相色谱法和液相色谱法。按分离原理的不同，可分为吸附色谱法、分配色谱法、离子交换色谱法和排阻色谱法（凝胶色谱法）等^[6]。色谱法的应用可以根据目的分为制备性色谱和分析性色谱两大类。制备性色谱的目的是分离混合物，获得一定数量的纯净组分^[7]，如在有机化学中分离化合物和精制提纯化合物^[8]。而分析性色谱的目的是定量或者定性测定混合物中各组分的性质和含量^[7]，如在有机化学中利用比移值鉴定化合物和跟踪反应进程^[8]。

色谱法是分析化学的一个分支学科，创始于20世纪初，1903-1906年俄国植物学家茨维特应用吸附原理，把碳酸钙装在一个竖立的玻璃管中，将植物叶子的石油醚提取液倒入管内，然后加入石油醚自上而下淋洗。随着淋洗的进行，样品中各种色素向下移动的速度不同，逐渐形成一圈圈不同层次的色带，它们分别是胡萝卜素、叶黄素和叶绿素A、叶绿素B。这些色带称为色层或色谱。茨维特所用的玻璃管称为色谱柱，管内的碳酸钙填充物称为固定相，淋洗液称为流动相或洗脱剂。后来色谱法不断发展，普遍用来分离无色物质，分离时并不产生色谱，但色谱法这个名称一直被沿用下来。^[4]

茨维特发现的经典色谱法由于分离速度慢，分离效率低，在随后的几十年中并没有引起足够的重视。直到1941年，马丁（Marin）和辛格（Synge）把氨基酸的混合液注人到以硅胶做固定相的柱中，用氯仿做流动相，将各个氨基酸的组分分开，才引起化学家的重视。这个方法形式上与茨维特的方法相似，但茨维特是借助于各组分在固定相中吸附能力的强弱不同而进行分离的，而马丁的分离是借助于氨基酸在硅胶中的水和有机溶剂氣仿两相中的溶解度不同而达到分离的，前者称为吸附色谱，后者称为分配色谱。1944年，马丁和辛格用滤纸代替硅胶，不用色谱柱，固定相是滤纸中含有水分的纤维素，流动相用有机溶剂，也成功地分离了氨基酸，从而创立了纸色谱法。^[5]

1952年，马丁等又提出以气体做流动相的气相色谱法，它给挥发性化合物的分离测定带来了划时代的变革。马丁和辛格由于对现代色谱法的形成和发展所做出的卓越贡献，荣获了1952年度的诺贝尔化学奖。20世纪50年代又出现了将固定相涂布在玻璃板上的薄层色谱法。1969年的高效液相色谱法的出现和20世纪70年代计算机技术进入色谱领域，出现了计算机控制的全自动色谱仪，导致现代色谱技术又进入了一个迅速发展的新时代—智能色谱时代，使得色谱法在现代分离分析技术中占有极其重要的地位。^[5]

由于色谱法具有高灵敏度、高选择性、高效能、分析速度快等特点，它不仅能解决组分复杂的样品分析问题，而且还可以制备纯组分，因此它在医药卫生、环境化学、高分子材料、石油化工等各个领域中成为一种不可缺少的分离、分析手段，尤其在药物分析中有着极为重要的地位，各国药典都收载了许多色谱法分析方法。^[4]

吸附色谱利用的是吸附剂（固定相）对被分离物质的吸附能力不同，用溶剂或气体(流动相)洗脱时，各组分在固定相中移动速度不同使混合物得以分离的方法。液-固吸附色谱是运用较多的一种方法，常用的吸附剂有硅胶、氧化铝聚酰胺、活性炭等有吸附活性的物质，色谱过程可以看作流动相分子与被分离物质分子之间竞争固定相吸附中心的过程。在洗脱过程中，当溶剂流过时，不同物质在吸附剂和溶剂之间不断地发生吸附、解吸、再吸附、再解吸。在这个过程中，吸附力强的物质解吸较难，移动的慢些，吸附力弱的物质解吸较易，移动的快些，经过一段时间的洗脱，不同物质就彼此分开了。^[9]

分配色谱是利用混合物中各成分在两种不相混溶的溶剂中分配系数不同，使组分分离的一种方法，相当于连续萃取分离法。分配色谱需要有载体固定相和流动性。载体是一种惰性的固体物质，主要起支持和固定溶剂的作用，所以又称支持剂。被涂布或键合在载体上的溶剂，称固定相，用来洗脱的溶剂即为流动相。^[9]

在洗脱过程中，流动相流经载体时与固定相发生接触，由于样品中各成分在两相之间的分配系数不同，因而随流动相移动的速度也不同，易溶于流动相中的成分移动快，而易溶于固定相中的成分移动慢，从而得以分离。流动相的极性小于固定相时，称正相分配色谱，流动相的极性大于周定相时，称反相分配色谱。^[9]

离子交换树脂为人工合成的多聚物，带一些电荷基团，这些带电基团与带相反电荷的离子结合。如果周围流动的介质中存在其他带相反电荷的离子，这些离子将与结合在树脂上的反离子进行交换。离子交换色谱是利用离子交换树脂上的可交换离子与被分离物质中的不同离子间发生交换反应时交换能力不同，或者说是基于混合物中各成分解离度差异进行分离的方法。^[9]

离子交换色谱主要适合于离子型化合物的分离，如中草药中的生物碱、有机酸、氨基酸、多肽等。化合物与离子交换树脂进行离子交换反应能力的强弱取决于分子解离度的大小、带电荷的多少等因素，分子解离度越大，越易交换在树脂上，越难被洗脱下来。比如不同碱性的生物碱盐被交换在强酸型阳离子交换树脂上，解离度小的弱碱比强碱先洗脱下来，借此实现分离。^[9]

大孔吸附树脂是一类不含交换基团且有大孔结构的高分子吸附剂，一般为白色颗粒状，理化性质稳定，不溶于酸、碱及有机溶剂。大孔树脂具有良好的大孔网状结构和较大的比表面积，可以有选择地吸附水溶液中的有机物，这种吸附性能主要是由于范德华引力或生成氢键的结果，同时由于大孔吸附树脂的多孔性结构使其对分子大小不同的物质具有筛选作用。所以大孔吸附树脂是一种吸附性和分子筛原理相结合的分离材料。影响吸附的因素大孔吸附树脂的比表面积、表面电性及能否与化合物生成氢键是影响吸附的重要因素。^[9]

凝胶色谱又称排阻色谱，是利用分子分离物质的一种方法。凝胶是具有三维空间的网状结构、呈珠状颗粒的物质。每个颗粒的细微结构及孔的直径均匀一致，像筛子，小分子可以进人凝胶网孔，而大分子则排阻于颗粒之外。当混合物样品加到层析柱上时，大分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移动，流程短，移动速率快，先被洗出层析柱;而小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再扩散出来，故流程长，移动速度慢，后被洗出层析柱，从而使样品中大小不同的分子获得分离。常用的凝胶有葡聚糖凝胶、羟丙基葡聚糖凝胶等。^[9]

色谱柱的（分离）效能常根据一对难分离组分的分离情况来判断。如A、B为难分离物质对，它们的色谱图可能有三种情况：一是A、B两组分未分离，色谱峰完全重叠；二是A、B两组分的色谱峰有一定距离，但峰形很宽，两峰严重重叠，分离不完全；三是A、B两峰间有一定距离，而且峰形较窄，分离完全。可见要使两组分分离，两峰间必须有足够的距离，而且要求峰形较窄。^[10]

在色谱分离技术发展的初期，马丁等人把色谱分离过程比拟为分馏过程，提出了塔板理论。这个半经验的理论把色谱柱比作一个分馏塔，柱内有若干想象的塔板，在每个塔板里，组分在气液两相间达成一次分配平衡。经过若干次分配平衡后，组分得以彼此分离，分配系数小的，即挥发度大的组分首先由柱内逸出。由于色谱柱的塔板数很多，致使分配系数仅有微小差异的组分也能得到很好的分离。^[10]

若色谱柱长为L，塔板间距离（理论塔板高度）为H，则色谱柱的理论塔板数n为：^[10]

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塔板理论是一种半经验性的理论，它用热力学的观点定量说明了溶质在色谱柱中移动的速率，解释了流出曲线的形状，并提出了计算和评价柱效能高低的参数。但色谱过程不仅受热力学因素的影响，而且还与分子的扩散、传质等动力学因素有关，因此塔板理论只能定性地给出板高的概念，却不能解释板高受哪些因素影响，也不能说明为什么在不同的流速下，可以测得不同的理论塔板数，因而限制了它的应用。^[10]

1956年荷兰学者范·弟姆特（Van Deemter）等人，在总结前人研究成果的基础上提出了速率理论，并归纳出一个联系各影响因素的方程式，称为速率理论方程式（亦称Van Deemter方程），即：^[10]

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式中：为流动相平均线速度，cm/s。其余各项参数物理意义如下：^[10]

（1）涡流扩散项A：由于样品组分分子进入色谱柱碰到填充物颗粒时，不得不改变流动方向，因而它们在气相中形成紊乱的类似涡流的流动，使得组分中的分子所经过的路径有的长，有的短，因而引起色谱峰形的扩展，分离变差。A与填充物的平均直径和填充的规则与否有关，与流动相的性质、线速度和组分性质无关。^[10]

（2）分子扩散项B：当样品以”塞子”形式进入色谱柱后，便在色谱柱的轴向上造成浓度梯度，使组分分子产生浓差扩散，其方向是沿着纵向扩散，故该项也称为纵向扩散项。采用摩尔质量大的载气可使B值减小，有利于分离。^[10]

（3）传质阻力项C：系统由于浓度不均匀而在气液、气固等不同相中发生的物质迁移过程，称为传质。影响这个过程进行速度的阻力，称为传质阻力。传质阻力系数C包括气相传质阻力系数Cg和液相传质阻力系数C1，C=Cg+C1。从传质阻力方面来说，采用粒度小的填充物和摩尔质量小的载气可提高柱效能；当载气流速增大时，传质阻力项就增大，成为塔板高度增加的主要原因。^[10]

速率理论指出了影响柱效能的因素，为色谱分离操作条件的选择提供了理论指导，但由上述分析可看出，许多影响柱效能的因素彼此以相反的效果存在。如流速加大，分子扩散项的影响减小，传质阻力项的影响增大；温度升高，有利于传质，但又加剧了分子扩散的影响等等。因此必须全面考虑这些相互矛盾的影响因素，选择适当的色谱分离操作条件，才能提高柱效能。^[10]

分离度R又称分辨率，是定量描述混合物中相邻两组分在色谱柱中分离情况的主要指标，它是相邻两组分的保留时间之差与两组分峰宽的平均宽度的比值：^[10]

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相邻两组分保留时间的差值反映了色谱分离的热力学性质；色谱峰的宽度则反映了色谱过程的动力学因素。因此，分离度概括了这两方面的因素，并定量地描述了混合物中相邻两组分的实际分离程度，可用它作为色谱柱的总分离效能的指标。^[10]

分离效能高

混合组分在两相间不断进行吸附、解吸（或脱吸）或分配等作用，在此不间断的重复过程中，各组分间的微小差别被多次（可高达106次）放大，产生各组分移动速度的不同，造成各组分出色谱柱的先后顺序的不同而达到分离。有时一个分析周期内可以分离十多个化合物，甚至上百个化合物。特别对于有机同系物和异构体的分离，色谱法比经典分离技术（如萃取、蒸馏、重结晶等）更有效。^[3]

分离和分析功能兼备

色谱法与光谱法的主要区别在于色谱法具有分离与分析两种功能，而光谱法不具备分离功能。色谱法是先将混合物分离，而后可逐个检测分析，或采用联用技术在线检测，实现分离和分析一并完成。采用高灵敏度的检测器可以分析痕量组分(ng/g级)，是分析混合物最有效的手段。^[3]

自动化程度高

色谱分析一般都可与先进的计算机技术结合，使仪器操作、分离分析自动完成，操作和数据处理简单、快速和准确。^[3]

应用范围广

色谱法可以分离分析无机、有机样品、低分子或高分子样品，甚至对热不稳定或有生物活性的样品，也可进行分离测定。其应用几乎涵盖所有的生产性领域。^[3]

色谱方法的种类很多，并且各类方法的原理、操作也不尽相同，但由不同方法检测得到的色谱图却是大同小异。色谱图的纵坐标为检测器的相应信号，单位是mV，其数值的大小与流动相中被分离组分含量有关；横坐标通常为流出物流出时间，单位是min或s，也可用流动相的流出体积或距离表示；在一定的进样量范围内，色谱流出曲线呈正态分布，根据色谱分离的原理，用适当的方法处理色谱图的数据，便可获得所分析试样的定性和定量结果。色谱图中一些常用术语及相关参数如下。^[6]

基线

基线是指在操作条件下，色谱柱后没有组分流出，仅有纯流动相入检测器时的流出曲线；稳定的基线应是一条平行与横坐标的直线，它可以反映检测系统的噪声随时间变化的情况。^[6]

色谱峰

当有组分流出时，色谱流出曲线中出现的峰形曲线，称为色谱峰。^[6]

峰高和峰面积

色谱峰顶点到峰底之间的垂直距离称为峰高；峰与峰底之间的面积为峰面积，峰高与峰面积可用于定量分析。^[6]

保留值

保留值表示试样中各组分在色谱柱中停留的时间或将组分带出色谱柱所需流动相体积的数值，保留至可用作定性分析；在一定色谱条件下，由于各组分的性质不同，在同1根色谱柱上的保留值也不同。在相同的操作条件下，组分与参比组分的调整保留值之比称为相对保留值。^[6]

分配系数

分配系数是指在一定温度压力下，组分在固定相和流动相之间分配达到平衡时的浓度比值。它与柱中固定相和流动相的体积无关，取决于组分及两相的性质，并随柱温、柱压变化而变化。它是高压液相色谱法中分配色谱的重要参数。^[6]

色谱法可按两相所处状态、色谱分离原理和操作形式分类。^[6]

按两相的物理状态可分为：气相色谱法和液相色谱法。气相色谱法适用于分离挥发性化合物。气相色谱法根据固定相不同又可分为气固色谱法和气液色谱法，其中以气液色谱法应用最广。液相色谱法适用于分离低挥发性或非挥发性、热稳定性差的物质。液相色谱法同样可分为液固色谱法和液液色谱法。此外还有超临界流体色谱法，它以超临界流体（界于气体和液体之间的1种物相）为流动相(常用CO2)，因其扩散系数大，能很快达到平衡，故分析时间短，特别适用于手性化合物的分析。^[6]

按原理分为吸附色谱法、分配色谱法、离子交换色谱法、排阻色谱法（又称分子筛、凝胶过滤凝胶渗透色谱法）和亲和色谱法。^[6]

按操作形式分类，固定相装在管柱内的谱法称为柱色谱法，柱色谱法中根据流动相的物理状态可分为气相色谱法、液相色谱法。固定相呈平面状的色谱法称为平面色谱法。按平面色谱材料不同，又可分为薄层色谱法和纸色谱法。^[6]

薄层色谱法

薄层色谱法又称薄层层析法，系指将供试品溶液点于薄层板上，在展开容器内用展开剂展开，使供试品所含成分分离，所得色谱图与适宜的标准物质按同法所得的色谱图对比，亦可用薄层扫描仪进行扫描，用于鉴定、检查或含量测定。然而，受效能、灵敏度、精密度、重现性、准确度等的限制，薄层色谱法很少用于生药成分的含量测定。^[11]

高效液相色谱法

高效液相色谱法是采用高压输液泵将规定的流动相泵入有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入柱内，各组分在柱内被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。高效液相色谱法具有分离效能高、分析速度快、重现性好、准确度和灵敏度高，适应范围广，流动相选择范围宽，色谱柱可反复使用以及组分易收集等优点，已成为生药成分分离和定性、定量分析不可缺少的工具。^[11]

气相色谱法

气相色谱法是采用气体为流动相（载气）流经装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法。物质或其衍生物气化后，被载气带入色谱柱进行分离，各组分先后进入检测器，用数据处理系统记录色谱信号。气相色谱法主要用于含挥发性成分的生药鉴定，其精密度高、分离效能高；但所得数据只有保留时间，多数情况下在高温下进行。若成分不气化，就不能进行分析，故应用范围受到一定限制。^[11]

色谱法的应用可以根据目的分为制备性色谱和分析性色谱两大类。^[7]

制备性色谱的目的是分离混合物，获得一定数量的纯净组分，这包括对有机合成产物的纯化、天然产物的分离纯化以及去离子水的制备等。相对于色谱法出现之前的纯化分离技术如重结晶，色谱法能够在一步操作之内完成对混合物的分离，但是色谱法分离纯化的产量有限，只适合于实验室应用。^[7]

分离混合物

色谱法的分离效果远比分馏、重结晶等一般方法好。一些结构类似、理化性质相似的化合物混在一起，采用一般方法难以分离时，应用色谱法往往会取得理想的分离效果。^[8]

精制提纯化合物

当有机化合物中含有少量结构类似的杂质不易除去时，可利用色谱法将杂质分开，得到纯净的化合物。^[8]

分析性色谱的目的是定量或者定性测定混合物中各组分的性质和含量。定性的分析性色谱有薄层色谱、纸色谱等，定量的分析性色谱有气相色谱、高效液相色谱等。色谱法应用于分析领域使得分离和测定的过程合二为一，降低了混合物分析的难度缩短了分析的周期，是目前比较主流的分析方法。^[7]

利用比移值鉴定化合物

在一定条件下，纯粹的化合物在薄层色谱法或纸色谱法中都有一定的移动距离，即比移值(R)。不同的化合物，其比移值一般不同。因而，可根据比移值的大小鉴别化合物的纯度或确定两种性质相似的化合物是否为同一种物质。为了确保结果的可靠性，应至少选用两种不同的溶剂体系进行比移值的测定。^[8]

跟踪反应进程

在化学反应过程中，可用薄层色谱法或纸色谱法观察原料色点的逐渐消失，跟踪化学反应的进程，以寻找出该反应的最佳反应时间和达到的最高反应产率。^[8]

现代色谱法具有分离与在线分析两种功能，不仅能解决复杂物质的分离、定性和定量分析，还可以分离制备纯组分。色谱法在对复杂物质的分离及分析上具有其他技术不可替代的特点，其发展趋势可以归结为如下几个方面：^[12]

固定相载体的研究取得了引人注目的成绩，粒径均匀、高强度的高分子多孔微球制备技术已相对成熟。但是随着粒径减小，仪器柱压将迅速提高，因此对填料及仪器的耐压性能要求明显提高，因而目前一般仪器所用填料粒径限制为3~5μm，最近新研制的超高效液相色谱可以使用粒径为1.7μm的填料，使高效液相色谱法分离分析的高选择性、高通量、高速度又上了一个新台阶。^[12]

检测方法也是色谱学研究的热点之一，人们不断更新检测器的灵敏度，使色谱法分析能够更灵敏地进行分析。除此以外，人们还将其他光谱技术引入色谱，如进行色谱-质谱联用、色谱-红外光谱联用、色谱-紫外吸收光谱联用等，在分离化合物的同时即可测定化合物的结构。色谱检测器的发展还伴随着数据处理技术的发展，检测获得的数据进行计算处理，使实验者获得更多信息。^[12]

色谱新方法也是色谱研究热点之一，毛细管电色谱法、低背景毛细管梯度凝胶电泳、手性色谱等近期发展起来的各种色谱新技术获得了一批达到国际先进水平的研究成果。毛细管电色谱法兼有毛细管电泳和微填充柱色谱法的优点，其应用研究越来越多，将成为最重要的色谱方法之一。以毛细管电泳为基础，由其集成化、小型化、自动化而形成的微全分析系统的重要分支—微流控芯片分析系统，是20世纪90年代末期才发展起来的分析技术。^[12]

联用技术是分析方法发展的重要趋势。色谱分离和光谱检测方法的联用，将色谱的分离效能和光谱的检测可靠性结合起来，能在复杂混合组分分离的基础上，进一步对组分的结构做出合理的判断，获得更多的组分定性定量信息。目前，最流行的联用技术有如下两类：色谱-色谱（或质谱）联用技术、色谱-色谱联用技术。^[12]